Línea de Control
Inmunizar un animal huésped con el o los anticuerpos de una especie diferente puede generar anticuerpos secundarios. Por ejemplo, la inyección de anticuerpos de ratón en un animal distinto de un ratón aumenta los anticuerpos secundarios anti-ratón. La cabra, el burro y el conejo son las especies hospedadoras más utilizadas para producir anticuerpos secundarios.
Los tipos más comunes de anticuerpos secundarios son los generados contra una población agrupada de inmunoglobulinas de una especie diana.
Por ejemplo, la inmunización de una cabra con IgG de ratón purificado generará anticuerpos IgG anti-ratón de cabra que se unirán a todas las clases, cadenas pesadas y ligeras (H L) Y fragmentos de IgG de ratón, así como cualquier otra molécula que comparta los dominios estrictamente conservados (e.g. IgM comparte las mismas cadenas ligeras kappa que IgG).
Por el contrario, inmunizar una cabra con solo anticuerpos IgG1 de ratón generará anticuerpos específicos para anticuerpos y moléculas IgG1 de ratón que comparten los dominios estrictamente conservados.
Debido al alto grado de conservación en la estructura de muchos dominios de inmunoglobulina, los anticuerpos secundarios de clase específica deben purificarse por afinidad y absorberse de forma cruzada para lograr una reacción cruzada mínima con otras inmunoglobulinas.
Los anticuerpos IgG1 de ratón inmovilizados pueden purificar todos los anticuerpos de cabra que se unen a IgG1 de ratón usando el ejemplo anterior. Paso a través de una (s) columna (s) de cromatografía que contiene IgG2a de ratón, IgG2b, IgG3, IgM, etc., refinaría adicionalmente estos anticuerpos anti-igg1 de ratón para eliminar cualquier anticuerpo de reacción cruzada con isotipos non-IgG1.
Además, el paso a través de columnas que contienen proteínas séricas inmovilizadas de especies distintas de las utilizadas para inmunizar al huésped puede purificar adicionalmente anticuerpos secundarios. Este método de adsorción cruzada (a menudo denominado "altamente adsorbido de forma cruzada") es una etapa de purificación adicional recomendada para aplicaciones cuando se usan anticuerpos primarios de múltiples especies y cuando las inmunoglobulinas u otras proteínas séricas pueden estar presentes en las muestras probadas.
Productos de línea de Control
| Anticuerpo | Aplicación |
| Conejo IgG | Para el inmunodiagnóstico: ELISA, LFA, CLIA |
| Ratón IgG | |
| Ratón IgM | |
| Pollo IgY | |
| Cabra Anti ratón IgG | |
| Cabra Anti conejo IgG | |
| Cabra Anti pollo IgY | |
| Ratón Anti humano IgG |
Control de isotipo
El propósito principal del control de isotipos es determinar que la unión del anticuerpo primario es específica, en lugar de receptores Fc no específicos o interacciones con otras proteínas. También puede unir anticuerpos de manera competitiva y realizar la misma función que los anticuerpos de bloqueo de función.
El control del isotipo debe ser completamente consistente con la fuente del anticuerpo primario, la tipificación de Ig y el etiquetado.
Un suero normal puede usarse como control negativo en el marcaje de inmunofluorescencia si el anticuerpo primario es policlonal. Debido a las diferentes fuentes de mAbs marcados con fluorescencia, los mAbs sin marcar de la misma fuente deben usarse como controles de isotipos para ajustar la tinción de fondo. Por ejemplo: por ejemplo, si el anticuerpo primario es anti-rata de ratón CD11b y clon ox-42 purificado IgG, su isotipo es ratón IgG2a, así que el ratón purificado IgG2a se puede utilizar como el control de isotipo o OX-42.
Control de isotipos: se refiere a la misma subclase de inmunoglobulina que el Moab en ratones no inmunizados, principalmente se consideraron factores como la autofluorescencia celular, la Unión de anticuerpos mediada por receptores de FC y la Unión de anticuerpos no específicos. Si se usa tinción directa de inmunofluorescencia, el control de isotipos también debe etiquetarse con pigmentos fluorescentes, como IgG1 FITC, IgG2a, PE, etc. Además, el control de isotipos y la concentración de fluorocromo marcado por Moab y la relación F:P (fluorocromo marcado a la relación de moléculas de inmunoglobulina) debe ser la misma que la mejor, Que es vital para el establecimiento preciso de puntos de referencia celulares negativos y positivos. No utilice un control de isotipo que no coincida con el MoAb, preferiblemente un producto preparado por el mismo laboratorio y utilizando el mismo proceso o método (como la misma marca).
Citometría de Flujo de Control de isotipos
El fragmento Fab del anticuerpo puede unirse a la superficie celular con baja afinidad y no especificidad, especialmente cuando la célula está muerta o la membrana celular está dañada; esta vinculación no específica será más obvia. Por lo tanto, los controles de isotipos se utilizan a menudo en experimentos para determinar los niveles de fluorescencia de fondo.
El control de isotipos solía ser una referencia negativa clásica en citometría de flujo. Para lograr la misma reactividad cruzada entre el control de isotipos y el anticuerpo, el isotipo, la especie, la fluoresceína, la fluoresceína, la relación de proteínas, la concentración y otros indicadores deben ser consistentes.
Precauciones:
1. Si la expresión del antígeno es una distribución bimodal y se separan los picos negativos y positivos, los resultados experimentales pueden comprender a través de la distribución bimodal.
2. Si las células cultivadas necesitan ser detectadas, entonces establecer el control de isotipo en este momento solo puede obtener alguna información que refleje la capacidad de adhesión celular, Y es difícil obtener información que refleje su fluorescencia no específica. Por lo tanto, establecer un control de isotipo para detectar células cultivadas no es ideal.
3. Si se utiliza una variedad de fluoresceína en el experimento al mismo tiempo, durante el análisis, se encuentra que la fuga de fluorescencia tiene un impacto significativo en los resultados, Y la fluorescencia de fondo no es evidente, no es adecuado para establecer el control de isotipo en este momento. Buena elección. (Los controles FMO son células de la misma especie, teñidas con todas las demás fluoresceinas con una fluoresceína eliminada de modo que la fuga de las diversas fluoresceinas al canal sin etiquetar se pueda manifestar y la puerta se pueda colocar en su lugar, así que, es un control necesario para la puerta. Y el control FMO solo es significativo cuando es esencial distinguir entre positivo y negativo con precisión. El control FMO ahora se usa comúnmente en experimentos multicolores y es necesario para experimentos multicolores).
4. Cuando se usa el control de isotipos, se encuentra que el nivel de unión no específico es muy alto, lo que puede deberse a la unión del extremo Fc no específico a la célula, dando como resultado una señal no específica, así que preste atención al bloqueo Fc.
5. Es necesario entender que el control de isotipos es solo una referencia para ayudarnos a filtrar algunos factores que afectan el experimento, pero no podemos determinar los puntos de corte positivos y negativos ni establecer una puerta en función de esto. Debemos saber que el control de isotipos solo puede reflejar la fluorescencia de fondo de la unión no específica, y la fluorescencia de fondo también es causada por otros factores, como autofluorescencia, alta compensación, anticuerpos, los métodos de etiquetado, los instrumentos, otros reactivos o análisis de datos y otros factores afectarán la fluorescencia de fondo.
6. Es necesario ajustar el anticuerpo objetivo para reducir la fluorescencia de fondo de la unión no específica, y no es adecuado para establecer un control de isotipo. Debido a la cantidad excesiva de anticuerpos, se producirá un cambio de pico negativo y un ensanchamiento de bases.
7. Si se detectan señalización celular y citocinas en el experimento, se debe establecer el control FMO y el control biológico negativo, prestando especial atención a las células no estimuladas o células tratadas con inhibidores de la fosforilación.
8. El tinte de viabilidad celular se añade al esquema multicolor para eliminar las células muertas. Debido a que la tinción no específica de las células muertas es extrema, si no se elimina, conducirá a una mayor unión no específica y afectará el experimento.
9. Está disponible para establecer otros controles además del control de isotipos en diferentes situaciones. Por ejemplo, para las células no teñidas, determinar los controles negativos para el Fondo y la autofluorescencia, establecer el voltaje PMT;
Para células completamente teñidas, determine algunos eventos fuera del eje, establezca el voltaje PMT; Para células/microesferas de una sola tinción, ajuste la compensación; Muestras no estimuladas o no tratadas, control negativo experimental; células positivas (o tratadas con fármacos estimuladas particulares), control práctico positivo.
